1. Seminář v laboratoři nanotoxikologie

Laboratoř nanotoxikologie se dlouhodobě věnuje testování vlivu znečištění ovzduší a nanočástic na plicní epitel. Využívají vysoce specializovaný a finančně nákladný 3D model plicního epitelu kultivovaný na insertech v 96jamkových destičkách v režimu air–liquid interface. Kultury jsou exponovány reálnému i syntetickému kontrolnímu vzduchu v monitorovacím inkubátoru umístěném v centru Prahy, kde sledují dopady znečištění na buněčné systémy. Vzhledem k nákladnosti modelu a experimentálním podmínkám je pro ně zásadní možnost provádět nelytické eseje umožňující sledování buněčné viability a toxicity v reálném čase bez nutnosti ukončení experimentu.

V rámci minisemináře jsme představili vhodné nástroje pro hodnocení viability a cytotoxicity kompatibilní s jejich experimentálním uspořádáním. Diskuse se postupně zúžila na dvě hlavní možnosti: RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay pro kontinuální, nelytické sledování viability a LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay pro stanovení uvolněné LDH jako markeru poškození buněk. Otevřeli jsme také téma oxidačního stresu, kde by teoreticky připadala v úvahu ROS-Glo™ esej, avšak vzhledem k nutnosti rozsáhlých kontrol a omezením jejich terénní monitorovací stanice se tato varianta aktuálně jeví jako méně praktická.

2. Testování rostlinných extraktorů

Laboratoř řeší projekt zaměřený na testování rostlinných extraktů (inspirovaných potravou orangutanů) proti střevním prvokům Giardia intestinalis/duodenalis a entamoébám. Důvodem je narůstající rezistence k metronidazolu, který se používá již od 60. let. Experimenty probíhají v režimu BSL3 a životaschopnost prvoků aktuálně hodnotí manuálně pomocí počítání v Bürkerově komůrce, což je časově náročné, a proto hledají jednodušší a reprodukovatelnější metodu.

Na semináři jsme diskutovali možnosti využití fluorescenčních a luminiscenčních esejí, konkrétně CellTiter-Blue®, MTS, CellTox™ a CellTiter-Glo®, které jsou již publikovány pro práci s Giardií. Probírali jsme také vhodné přístrojové vybavení (Promega GloMax®, přístroje od Molecular Devices) a možnost propojení s laboratoří z CEITECu, která má zkušenosti s Spectramax iD3 od Molecular Devices v BSL2/3 režimu (není je k dispozici nová generace přístroje Spectramax iD3s). Diskutovali jsme možnost zapůjčení dema přístroje dema, na kterém by si vyzkoušeli práci se CellTiter-Glo®.

CellTiter-Blue®	CellTiter 96 AQueous MTS Reagent Powder
CellTox Green Cytotoxicity Assay	CellTiter-Glo®

3. Model senzibilizace plicního epitelu

Skupina se dlouhodobě věnuje hodnocení kožní senzibilizace a nově připravuje model senzibilizace plicního epitelu na air–liquid interface organoidech kultivovaných v insertech. U kosmetických prostředků využívají linii LuSens s luciferázovým reportérem Nrf2-ARE (substrát od Promegy), u zdravotnických prostředků se stále používá lymph node assay s následným stanovením proliferace lymfocytů pomocí CellTiter-Glo®.

V rámci semináře jsme prošli možnosti měření viability a cytotoxicity, reportérové eseje pro senzibilizaci (včetně CYP-Glo™), mitochondriální toxicitu (MitoTox-Glo™) i stanovení cytokinů pomocí Lumit® imunoesejí. U plicních modelů zatím není metodika pevně ustálená, jako nejperspektivnější se však jeví měření cytokinů, kde oceňují citlivost a široký lineární rozsah technologie Lumit®. Cenově je metoda srovnatelná s klasickou ELISA (cca 24 000 Kč/100 vzorků vs. Lumit® přibližně 20 000 Kč).

4. CAR-T buňky a solidní nádory u dětských pacientů

Tým se věnuje vývoji a přípravě CAR-T buněk se zaměřením především na solidní nádory u dětských pacientů (např. glioblastomy). Hledají robustní a efektivní nástroje pro hodnocení úspěšnosti přípravy CAR-T (včetně TCR-KO buněk), sledování cytotoxicity a produkce cytokinů, stejně jako vhodná média pro expanzi, se kterými zatím nejsou plně spokojeni.

V rámci semináře jsme prošli bioeseje pro charakterizaci CAR-T buněk, využití HiBiT technologie pro sledování zabíjení nádorových buněk, Lumit® imunoeseje pro rychlé a citlivé stanovení cytokinů jako alternativu k aktuálně používaným (nákladným a pracným) kitům a také možnosti médií T-VIVO pro expanzi. Nabídnut byl vzorek T-VIVO k otestování. Diskutovali jsme rovněž live-cell imaging včetně systému Maestro™ Z a zmíněna byla i dostupnost GLP softwaru vhodného pro klinické laboratoře.

T Cell Activation Bioassay (NFAT)	Nano-Glo HiBiT Extracellular Detection System
TheraPEAK® T-VIVO® Cell Culture Medium	Maestro Z

5. Online seminář na kultivaci CHO a HEK

Online seminář byl zaměřen na kultivaci CHO a HEK buněk a možnosti zvýšení produkce proteinů. Tým s touto kultivací začíná, buňky bude nutné adaptovat na nová média a optimalizovat produkci pomocí feed suplementů. Budou poskytnuty vzorky médií a pracovní postupy, po otestování proběhne vyhodnocení a navazující call.

V diskusi zazněla pozitivní zkušenost s DMEM médiem i dotaz na využití kryopreservačního média pro CHO a HEK buňky. Řešena byla také možnost média pro Sf9 buňky, ať už budoucí produkt nebo případná zakázková výroba.