Analýza RNA krok za krokem: od izolace přes RT qPCR až po RNA seq

Obsah

1. Izolace RNA: první krok ke spolehlivým výsledkům
   1.1. Rychlá manuální izolace RNA
   1.2. Automatizovaná izolace RNA pomocí Maxwell®
2. Ochrana RNA před degradací
3. Kvantifikace RNA: víte, kolik RNA skutečně máte?
4. Celková RNA, nebo pouze mRNA?
5. Reverzní transkripce: převod RNA na cDNA
6. RT qPCR
7. Příprava vzorků pro RNA seq
8. Závěr

Práce s RNA vyžaduje pečlivější přístup než většina běžných DNA aplikací. RNA je citlivá k degradaci a chyba v prvních krocích analýzy se může projevit až mnohem později, například vysokou variabilitou RT qPCR, nízkým výtěžkem cDNA nebo nekvalitní knihovnou pro RNA seq.

Úspěch analýzy proto začíná už správným zpracováním vzorku a izolací RNA. Pokračuje ochranou RNA před degradací, přesnou kvantifikací a volbou vhodného způsobu následné analýzy. V tomto článku projdeme jednotlivé kroky od vstupního vzorku až po RT-qPCR nebo přípravu materiálu pro RNA seq.

1. Izolace RNA: první krok ke spolehlivým výsledkům

Základem každé analýzy je čistá a dostatečně intaktní RNA bez látek, které mohou negativně ovlivnit reverzní transkripci, PCR nebo přípravu sekvenační knihovny.

Vhodný způsob izolace se odvíjí především od typu vstupního materiálu, požadované RNA frakce a počtu zpracovávaných vzorků. Jiný přístup může být vhodný pro kultivované buňky, jiný pro tkáň, plnou krev, plazmu, FFPE materiál nebo rostlinná pletiva.

1.1. Rychlá manuální izolace RNA

Pro menší série vzorků představuje praktické řešení kolonková izolace pomocí systémů ReliaPrep™ (obr. 1).

ReliaPrep™ RNA Cell Miniprep System je určený pro izolaci celkové RNA z kultivovaných buněk. Hodí se i při malém množství vstupního materiálu a součástí izolačního procesu je ošetření DNázou přímo na koloně. Odpadá tak samostatný krok odstraňování genomové DNA a při izolaci není potřeba pracovat s fenolem ani chloroformem.

Pro pevné tkáně lze použít ReliaPrep™ RNA Tissue Miniprep System. Systém je optimalizovaný pro práci s tkáňovým materiálem a RNA lze eluovat v malém objemu, což je výhodné zejména tehdy, pokud potřebujete získat koncentrovaný vzorek pro následnou analýzu.

Obrázek 1. Výtěžek RNA po její izolaci z HeLa buněk prostřednictvím ReliaPrep RNA System.

Pokud vás zajímají také malé RNA, například miRNA a další malé nekódující RNA molekuly, je vhodné použít systém určený přímo pro jejich záchyt. ReliaPrep™ miRNA Cell and Tissue Miniprep System umožňuje izolovat celkovou RNA včetně malých RNA, které se při některých standardních postupech mohou částečně ztrácet.

1.2. Automatizovaná izolace RNA pomocí Maxwell®

S rostoucím počtem vzorků začíná být čas strávený pipetováním, centrifugací a opakováním jednotlivých purifikačních kroků významnou součástí pracovního dne. V takové situaci lze izolaci automatizovat pomocí systému Maxwell® (obr. 2).      

   
Obrázek 2. Přístroj Maxwell RSC pro automatickou izolaci nukleových kyselin. Dostupný ve verzi pro 1-16 či 1-48 vzorků.

Vzorek se připraví podle příslušného protokolu, vloží se do předplněné kazety a vlastní purifikaci následně provede přístroj. Výsledkem je menší počet manuálních kroků, ušetřený čas a především konzistentnější zpracování větších sérií vzorků.

Výhodou systému Maxwell® je také možnost pracovat s výrazně širším spektrem vstupních materiálů. Vedle kultivovaných buněk a běžných tkání lze podle použitého kitu izolovat RNA například z plné krve, rostlinných pletiv, plazmy, séra nebo FFPE materiálu.

Pokud se tedy ve vašem projektu střídají různé typy vzorků, nemusíte pokaždé měnit celý princip izolace. Na stejné platformě lze podle zvoleného kitu zpracovávat buňky, tkáně, krev, plazmu, sérum i FFPE materiál.

NOVINKA! RNA i DNA z jednoho FFPE vzorku Pokud potřebujete z jednoho cenného FFPE řezu získat více informací, Maxwell® RSC XtractAll FFPE DNA/RNA Kit umožňuje zvolit izolaci DNA, RNA, celkových nukleových kyselin nebo sekvenční izolaci DNA a RNA ze stejného vzorku. To je výhodné například v projektech, kde chcete kombinovat genomickou a transkriptomickou analýzu, ale množství vstupního materiálu je omezené.

Pro laboratoře pracující v režimu in vitro diagnostiky (IVD) jsou určeny přístroje řady Maxwell® CSC. Na rozdíl od výzkumných systémů RSC podporují vedle výzkumného režimu (RUO) také režim IVD a jsou vyráběny v souladu s požadavky cGMP a relevantními předpisy pro diagnostické zdravotnické prostředky, včetně evropského nařízení EU IVDR 2017/746.

Uvažujete o automatizaci izolace DNA a RNA, ale před pořízením přístroje si chcete ověřit jeho fungování přímo ve své laboratoři? Nabízíme možnost zapůjčení DEMO přístroje Maxwell.

2. Chraňte RNA před degradací

 Úspěšnou izolací riziko pro RNA nekončí.

Enzymy RNázy (obr. 3) se běžně vyskytují v biologických vzorcích i v laboratorním prostředí a jsou mimořádně stabilní. Vedle správných zásad tzv. RNase-free práce proto může být vhodné RNA během citlivých enzymatických kroků chránit inhibitorem RNáz.

Obrázek 3. Výskyt RNáz je v laboratorním prostředí běžný a RNA je tak třeba před nimi adekvátně chránit, ať už dodržováním správných zásad práce s RNA či přidáním protektivní chemie.. Generováno ChatGPT (Open AI)

Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor (obr. 4) inhibuje běžné RNázy typu A, B a C a lze jej použít například během práce s izolovanou RNA nebo reverzní transkripce.

Pro náročnější podmínky je vhodný RNasin® Plus RNase Inhibitor. Oproti standardní variantě má zvýšenou odolnost vůči oxidaci a vyšší teplotní stabilitu.

RNasin samozřejmě nenahrazuje správnou práci s RNA. Funguje jako další pojistka v okamžiku, kdy by degradace RNA mohla znehodnotit celý experiment.

Obrázek 4. Agarózový gel zobrazující degradaci RNA bez adekvátní protekce (vlevo) a snímek agarozového gelu se vzorky RNA po přidání RNasin Ribonuclease Inhibitor (vpravo). Přítomnost RNasin uchová RNA intaktní pro následné aplikace a zvyšuje tak
spolehlivost výsledků.

3. Kvantifikace RNA: víte, kolik RNA skutečně máte?

Po izolaci je potřeba zjistit, kolik RNA máme k dispozici pro reverzní transkripci, RT-qPCR nebo přípravu RNA-seq knihovny.

Spektrofotometrie je rychlá a poskytne také informace o poměrech absorbance. Její nevýhodou je však omezená specificita. Signál při 260 nm nemusí pocházet pouze z RNA a zejména u nízkých koncentrací může být výsledná hodnota ovlivněna dalšími látkami ve vzorku.

Pokud potřebujete přesněji stanovit množství RNA, je vhodná fluorometrická kvantifikace.

QuantiFluor® RNA Select System je vhodný pro přesnou kvantifikaci RNA v širokém rozsahu koncentrací. Barvivo je specifické pro RNA, takže měření není výrazně ovlivněno přítomností DNA ve vzorku. To je výhodné zejména před aplikacemi, kde záleží na přesné normalizaci vstupního množství RNA. Systém pokrývá rozsah přibližně 1,6 až 100 ng/µl RNA při použití 10 µl vzorku a oproti konkurenci kombinuje citlivé i širokorozsahové měření v jednom kitu.

Připravený pracovní roztok barviva lze použít opakovaně a samotné měření lze provádět jak na dostupných fluorimetrech, například Quantus™ Fluorometer či Qubit, tak na přístrojích pro mikrotitrační destičky. Díky tomu se systém hodí pro několik jednotlivých vzorků i pro větší série.

Uvažujete o pořízení fluorimetru, ale před pořízením přístroje si chcete ověřit jeho fungování přímo ve své laboratoři? Nabízíme možnost zapůjčení DEMO přístroje Quantus™ Fluorometer (obr. 5).

 

Obrázek 5. Quantus Fluorometer pro fluorescenční stanovení koncentrace RNA či DNA.

4.Potřebujete celkovou RNA, nebo pouze mRNA?

Ne každá aplikace vyžaduje práci s celkovou RNA.

Pokud vás zajímají především protein kódující transkripty, může být vhodné vzorek obohatit o polyadenylovanou mRNA.

PolyATtract® mRNA Isolation System  využívá oligo(dT) k zachycení poly(A) konců eukaryotických mRNA. Tím lze ze vzorku získat mRNA frakci a omezit zastoupení ostatních druhů RNA.

5. Reverzní transkripce: převod RNA na cDNA

Pokud je dalším krokem analýza RNA pomocí PCR, je nejprve potřeba převést RNA na komplementární DNA neboli cDNA. Tento krok katalyzuje enzym reverzní transkriptáza a označuje se jako reverzní transkripce.

Volba vhodné reverzní transkriptázy závisí na charakteru RNA a požadované aplikaci.

GoScript™ Reverse Transcription System obsahuje všechny hlavní komponenty potřebné pro syntézu cDNA, včetně reverzní transkriptázy, reakčního pufru, nukleotidů, oligo(dT) primerů, náhodných primerů a inhibitoru RNáz. GoScript™ Reverse Transcriptase je založena na rekombinantní M-MLV reverzní transkriptáze a v kombinaci s optimalizovaným reakčním pufrem umožňuje účinnou syntézu cDNA z krátkých i dlouhých a různě abundantních RNA transkriptů.

M-MLV Reverse Transcriptase pochází z Moloney Murine Leukemia Virus a jedná se o RNA dependentní DNA polymerázu (RdRp) vhodnou pro syntézu cDNA z RNA, včetně dlouhých mRNA templátů.

AMV Reverse Transcriptase, odvozená z Avian Myeloblastosis Virus, je vhodná zejména pro reverzní transkripci RNA s výraznou sekundární strukturou. Enzym je stabilní při vyšších reakčních teplotách, přibližně 37 až 58 °C. Vyšší teplota pomáhá narušit sekundární struktury RNA a může tak usnadnit syntézu cDNA z obtížně přepisovatelných RNA templátů.

6. RT-qPCR a akce do konce roku

Tématu RT-qPCR jsme se věnovali v našem nedávném článku. Stále můžete využit slevu 40 % z katalogové ceny na vybrané produkty.

V rámci akce můžete objednat jeden nebo více kusů každého qPCR produktu, který jste dosud neobjednávali.

Pro získání slevy stačí při objednávce uvést promokód qPCR2026.

Podívejte se na seznam produktů zahrnutých do akce a kompletní podmínky nabídky.

Pokud chcete nový qPCR kit nejprve porovnat se systémem, který používáte nyní, může vám pomoci také praktický průvodce pro správné nastavení porovnávacího experimentu. Provede vás například přípravou standardní křivky a porovnáním účinnosti, linearity, specificity, citlivosti a reprodukovatelnosti qPCR systémů.

Průvodce pro úspěšné porovnání qPCR Master Mixů naleznete zde. 

7. Příprava vzorků pro RNA-seq

U RNA-seq jsou kvalitní izolace a přesná kvantifikace pouze první kritickou částí. Před sekvenováním je potřeba připravit knihovnu s vhodnou koncentrací, čistotou a distribucí velikosti fragmentů.

Právě zde lze využít ProNex® Size Selective Purification System.

ProNex využívá magnetické částice pro manuální ale i automatizované přečištění dsDNA a umožňuje zároveň pracovat s požadovaným velikostním rozsahem fragmentů. To je užitečné při přípravě NGS knihoven, kdy potřebujete odstranit příliš krátké nebo příliš dlouhé fragmenty a získat reprodukovatelnější distribuci výsledné knihovny.

Závěr

Analýza RNA je řetězec správně nastavených kroků. Dobře navržený pracovní postup s kvalitními reagenciemi nejen zjednodušuje práci v laboratoři a šetří čas vlivem opakování, ale pomáhá také omezit variabilitu mezi vzorky, množství opakovaných experimentů, a především zvýšit důvěru ve výsledná data.

Výše zmíněné produkty pro analýzu RNA od společnosti Promega vám do vašich experimentů, ale zejména výsledků, přesně tuto kvalitu doručí.