Zlepšete kvantifikaci DNA a RNA s GoTaq® qPCR a využijte 40% slevu pro nové zákazníky

Obsah

• End point PCR vs qPCR
• Základní princip qPCR
• Dye based qPCR: detekce barvivem BRYT Green® Dye
• Probe based qPCR: sekvenčně specifická detekce
• RNA jako vstupní materiál pro qPCR
• GoTaq® Endure pro náročné vzorky
• GoTaq® Enviro pro environmentální vzorky
• Akční nabídka GoTaq® qPCR produktů se slevou 40 %
• Důležité otázky k zamyšlení na závěr
• Závěr

End-point PCR vs qPCR

U klasické end-point PCR se množství vzniklého produktu posuzuje až po dokončení všech amplifikačních cyklů. Výsledek se obvykle hodnotí pomocí agarové elektroforézy, která umožní ověřit přítomnost a přibližnou velikost PCR produktu.

Kvantitativní real-time PCR, zkráceně qPCR, naproti tomu sleduje vznik produktu během reakce. Po každém cyklu se měří fluorescenční signál, jehož změna odráží postupující amplifikaci cílové sekvence.

Základní princip qPCR

Při qPCR přístroj v průběhu každého cyklu měří fluorescenci. Signál může vznikat buď navázáním fluorescenčního barviva na dvouřetězcovou DNA, nebo pomocí fluorescenčně značené sondy specifické pro cílovou sekvenci. S rostoucím množstvím PCR produktu se mění také intenzita měřeného signálu.

Obrázek 1. Schéma Real-time PCR (qPCR). Osa x udává počet proběhlých cyklů. Osa y pak hodnotu zaznamenané fluorescence.

Základním výsledkem je amplifikační křivka (obr. 1). Hodnota Cq, někdy označovaná také jako Ct, udává cyklus, ve kterém fluorescenční signál překročí stanovený práh nad úrovní pozadí. V rámci stejné metody a stejného nastavení analýzy obecně platí, že nižší Cq odpovídá vyššímu množství výchozí cílové sekvence.

Z hlediska detekční chemie se nejčastěji rozlišují dva přístupy (obr. 2):

• dye-based qPCR, tedy detekce pomocí fluorescenčního barviva vázajícího se na dvouřetězcovou DNA,
• probe-based qPCR, tedy detekce pomocí sekvenčně specifické fluorescenční sondy.  

Obrázek 2. Schéma dye-based a probe-based qPCR reakce. Při dye-based probíhá detekce skrze vazbu fluorescenčního barviva na dsDNA. U probe-based je detekce založena na základě fluorescenčně značené hybridizační sondy.

Dye-based qPCR: detekce barvivem BRYT Green® Dye

Při dye-based qPCR se používá barvivo, které má v nenavázaném stavu pouze nízkou fluorescenci. Po navázání na dvouřetězcovou DNA však jeho fluorescenční signál výrazně vzroste. Čím více PCR produktu během reakce vzniká, tím více barviva se naváže a tím vyšší signál přístroj naměří.  

Pro kvantifikaci DNA přichází Promega s GoTaq® qPCR Master Mix  a inovativním barvivem BRYT Green®, alternativou k rozšířenému SYBR® Green I. Excitační a emisní vlastnosti jsou se SYBR® Green I obdobné a BRYT Green® je tak kompatibilní se všemi běžně dostupnými přístroji. Oproti SYBR® Green I je BRYT Green® pro samotnou amplifikační reakci navíc méně inhibiční a lze jej tak použít ve vyšší koncentraci, což má za přímý následek vyšší hodnoty fluorescence a citlivější detekci i méně abundantních cílových sekvencí.

GoTaq® qPCR Master Mix je tak praktickou volbou při přechodu ze zavedené metody založené na SYBR Green, neboť zachovat lze primery i odpovídající optický kanál přístroje.

Probe-based qPCR: sekvenčně specifická detekce

Probe-based qPCR, jako např. GoTaq® Probe qPCR Master Mix , používá kromě primerů také sondu komplementární k určité sekvenci uvnitř cílového amplikonu. U běžné hydrolyzační sondy je na jednom konci umístěn fluorescenční reportér a na druhém zhášeč. Dokud jsou oba prvky blízko sebe, je fluorescence reportéru potlačena. Při prodlužování nového řetězce je navázaná hydrolyzační sonda štěpena 5′→3′ exonukleázovou aktivitou polymerázy. Oddělením reportéru od zhášeče vznikne měřitelný fluorescenční signál, který se s dalšími cykly kumuluje.

Použitím několika sond značených různými fluorofory lze v jedné reakci rozlišit více cílových sekvencí. Probe-based qPCR je proto vhodná pro multiplexní analýzy, rozlišení blízce příbuzných cílů nebo práci s komplexnějšími vzorky.  

Pro probe-based qPCR poskytujeme kompletní řešení. Kromě GoTaq® Probe qPCR Master Mix nabízíme v rámci spolupráce s firmou Metabion syntézu oligonukleotidů na míru včetně fluorescenčně značených sond pro qPCR.  

RNA jako vstupní materiál pro qPCR

Při analýze RNA nelze vzorek použít přímo jako templát pro qPCR. RNA je nejprve nutné pomocí reverzní transkriptázy (RT) přepsat do komplementární DNA, označované jako cDNA. Ta následně slouží jako templát pro qPCR a kvantifikaci množství mRNA konkrétního genu.

RT-qPCR lze provést dvěma způsoby:

• Jednokroková RT-qPCR (1-step RT-qPCR)
• Dvoukroková RT-qPCR (2-step RT-qPCR)

1-step RT-qPCR: reverzní transkripce a qPCR v jedné reakci

U 1-step RT-qPCR probíhá reverzní transkripce RNA a následná qPCR ve stejné zkumavce nebo jamce. Reakční směs obsahuje reverzní transkriptázu, DNA polymerázu a další složky potřebné pro oba procesy. Po vytvoření cDNA pokračuje reakce bez další manipulace amplifikací a fluorescenční detekcí.  

GoTaq® 1-Step RT-qPCR System  kombinuje GoScript™ Reverse Transcriptase a GoTaq® qPCR Master Mix v jedné reakci. Detekce je založena na barvivu BRYT Green®. Součástí enzymové směsi je také RNasin® Plus RNase Inhibitor , který pomáhá chránit RNA během přípravy a reverzní transkripce.

GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System  spojuje GoScript™ Reverse Transcriptase s GoTaq® Probe qPCR Master Mix. GoScript™ RT Mix obsahuje reverzní transkriptázu, RNasin® Plus RNase Inhibitor a přísady optimalizované pro spojenou reakci.

2-step RT-qPCR: samostatná syntéza cDNA a následná qPCR

U 2-step RT-qPCR probíhá syntéza cDNA a vlastní qPCR ve dvou samostatných reakcích. Nejprve je RNA přepsána do cDNA. Část připravené cDNA se následně přenese do qPCR reakce s příslušnými primery a případně sondou.  

GoTaq® 2-Step RT-qPCR System obsahuje komponenty GoScript™ Reverse Transcription System pro syntézu cDNA a GoTaq® qPCR Master Mix s BRYT Green® pro následnou dye-based qPCR. Produktem prvního kroku je samostatná cDNA, kterou lze rozdělit do více qPCR reakcí.

GoTaq® Probe 2-Step RT-qPCR System používá pro syntézu cDNA GoScript™ Reverse Transcription System a pro následnou sekvenčně specifickou detekci GoTaq® Probe qPCR Master Mix. Je vhodný zejména tehdy, když má být jedna cDNA analyzována pomocí více probe-based reakcí nebo multiplexního uspořádání.

GoTaq® Endure pro náročné vzorky

Produktová řada Endure zahrnuje dva hlavní produkty:

• GoTaq® Endure qPCR Master Mix pro DNA,
• GoTaq® Endure RT-qPCR System pro 1-step RT-qPCR

Oba produkty jsou určeny pro probe-based detekci pomocí hydrolyzačních sond. Jejich formulace je optimalizována pro vzorky, u kterých mohou standardní qPCR reagencie ztrácet výkon v důsledku přítomnosti inhibitorů, např. huminových kyselin, heparinu, hematinu, ethanolu, EDTA a citrátu sodného.

GoTaq® Endure je tak vhodný pro amplifikaci DNA/RNA ze vzorků půdy, fekálních a dalších přírodních vzorků, analýzu RNA z listů rostlin bohatých na inhibitory a detekci RNA virů z veterinárních vzorků. 

Obrázek 3. Aplikace GoTaq Endure je vhodná v případě vzorků pocházejících z půdy, listů, vzorků fekálních či veterinárních.

GoTaq® Enviro pro environmentální vzorky

Pro environmentální matrice jsou vhodné:

• GoTaq® Enviro qPCR System pro DNA,
• GoTaq® Enviro RT-qPCR System pro 1-step RT-qPCR

Oba systémy používají sekvenčně specifickou detekci pomocí hydrolyzačních sond. Jsou optimalizovány pro cíle izolované z environmentálních vzorků, jako jsou voda, půda nebo biologický materiál, které mohou obsahovat huminové a tříslové kyseliny i další látky,
které snižují aktivitu DNA polymerázy nebo reverzní transkriptázy.

Obrázek 4. GoTaq Enviro je ideální použít pro analýzu vzorků z vody (včetně odpadní), půdy a biologického materiálu.

Pro analýzu vod, včetně odpadních, lze přímo využít specializované systémy s předdefinovanými sadami primerů, sond a kontrol pro konkrétní cíle:

• GoTaq® Enviro Wastewater Flu A, Flu B 
• GoTaq® Enviro Wastewater Flu A, Flu B, SC2 System
• GoTaq® Enviro WW SARS-CoV2 N1/N2 System
• GoTaq® Enviro WW SARS-CoV2 E/N2 System
• GoTaq Legionella pneumophila qPCR Kit
• GoTaq Legionella spp/pneumophila/SG1 qPCR Kit

Akční nabídka GoTaq® qPCR produktů se slevou 40 %

Zaujaly Vás qPCR kity od Promegy? Pak pro Vás máme dobrou zprávu. Pro nové zákazníky je nyní k dispozici sleva 40 % z katalogových cen na vybrané qPCR kity. Z každého produktu lze v rámci akce objednat jeden kus. Pro uplatnění slevy je nutné uvést promokód qPCR2026. Seznam kitů, na které se akce vztahuje, včetně bližších informací, naleznete v tomto odkazu.

Aby byl případný přechod na nový kit co nejjednodušší, připravila Promega praktického průvodce, který Vám s tímto procesem pomůže. Průvodce nalezenete ZDE a také na konci tohoto článku.

Důležité otázky k zamyšlení na závěr

1. Kdy zvolit dye-based a kdy probe-based qPCR?

Dye-based přístup je vhodný pro rutinní analýzu jednoho cíle, dobře optimalizované primery a situace, kdy je důležitá jednoduchost a nižší cena reakce. Vhodným produktem je GoTaq® qPCR Master Mix, případně GoTaq® 1-Step nebo 2-Step RT-qPCR System pro RNA.

Probe-based přístup zvolte, pokud potřebujete vyšší specificitu fluorescenční detekce, rozlišení blízce příbuzných sekvencí nebo multiplex. Pro standardní vzorky lze použít GoTaq® Probe qPCR a RT-qPCR systémy.

2. Je vhodnější 1-step, nebo 2-step RT-qPCR?

1-step RT-qPCR je vhodná pro rutinní analýzu, vyšší počet vzorků, automatizaci a situace, kdy je prioritou krátký pracovní postup. Pro dye-based detekci použijte GoTaq® 1-Step RT-qPCR System, pro probe-based detekci GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System.

2-step RT-qPCR zvolte tehdy, když potřebujete analyzovat více genů z jednoho vzorku, uchovat cDNA nebo samostatně optimalizovat reverzní transkripci a qPCR. Použít lze GoTaq® 2-Step RT-qPCR System nebo GoTaq® Probe 2-Step RT-qPCR System.

3. Je potřebná multiplexní analýza?

Pro multiplexní detekci je vhodnější probe-based chemie. Každý cíl dostane vlastní sondu s fluoroforem, který musí být rozlišitelný optikou přístroje. Pro standardní vzorky je vhodný GoTaq® Probe qPCR Master Mix nebo odpovídající Probe RT-qPCR systém. U náročných vzorků lze zvolit GoTaq® Endure qPCR Master Mix či RT-qPCR Systém.

4. Obsahují vzorky inhibitory?

Pokud vzorky obsahují inhibitory, vybírejte podle jejich původu:

• GoTaq® Endure pro obecně náročné vzorky s možným obsahem EDTA, ethanolu, heparinu, hematinu, citrátu nebo huminových kyselin,
• GoTaq® Enviro pro environmentální vzorky, zejména vodu, půdu a matrice s huminovými nebo tříslovými kyselinami.

Závěr

Správný qPCR kit je potřeba vybírat podle výchozí nukleové kyseliny, požadované detekční chemie, počtu analyzovaných cílů, možností přístroje a čistoty vzorku. Promega nabízí řešení pro standardní dye-based i probe-based qPCR, 1-step RT-qPCR, flexibilní 2-step RT-qPCR a také specializované systémy pro náročné nebo environmentální vzorky obsahující inhibitory.

GoTaq® qPCR Master Mix s BRYT Green® umožňuje využít jednoduchý pracovní postup a optické nastavení běžně používané pro SYBR Green I. GoTaq® Probe systémy poskytují sekvenčně specifickou detekci a možnost multiplexu. GoTaq® Endure je určen pro obecně náročné vzorky s vyšším obsahem inhibitorů, zatímco GoTaq® Enviro se zaměřuje analýzu vzorků z environmentální matrice.

Pro snadné porovnání vašeho stávajícího qPCR kitu s alternativním řešením GoTaq qPCR kitů od Promega a pro případný jednodušší přechod na nový produkt lze využít přiložený manuál „Guidelines for a Successful qPCR Master Mix Comparison “. Manuál pomáhá nastavit paralelní porovnání reagencií a doporučuje hodnotit specificitu, opakovatelnost, linearitu, citlivost a účinnost v celé koncentrační řadě templátu, nikoli pouze rozdíl jedné hodnoty Cq.

Zaujalo Vás toto řešení? Máte otázky nebo potřebujete poradit s výběrem? Jsme tu pro vás:

Autor článku: Mgr. Lukáš Išler Aplikační specialista pro molekulární a buněčnou biologii email: lukas.isler@eastport.cz tel.: 725 320 796