Budoucnost testování endotoxinů? Moderní metody bez živočišných surovin

Obsah článku

1. Úvod: Význam testování bakteriálních endotoxinů

• Proč je riziko nejvyšší u parenterálních přípravků
  · Kde mohou endotoxiny vzniknout nebo se objevit během výroby
  · Rozdíl mezi sterilitou a nepřítomností endotoxinů

2. Metody detekce endotoxinů: LAL a rekombinantní alternativy
   · Porovnání detekce endotoxinu metodami rFC a LAL
3. Udržitelnost v endotoxinovém testování

• Potřeba přechodu na animal-free metody
  · PyroGene® Assay jako udržitelná alternativa

4. Praktická doporučení při testování endotoxinů
5. Často kladené dotazy

Význam testování bakteriálních endotoxinů

Bakteriální endotoxiny jsou složky vnější membrány gramnegativních bakterií. Z biologického hlediska se jedná především o lipopolysacharidy (LPS), které se mohou uvolňovat při růstu, odumírání nebo rozpadu bakteriálních buněk.

Endotoxiny mohou u člověka vyvolat pyrogenní reakci, tedy horečku, dále zimnici, nevolnost, zvracení, zánětlivou odpověď organismu a v závažných případech i septický šok nebo život ohrožující stav. Riziko je obzvláště významné u přípravků, které jsou podávány přímo do krevního oběhu, tkání, centrálního nervového systému nebo jiných částí organismu.

Proto je testování bakteriálních endotoxinů zásadní součástí kontroly kvality zejména u parenterálně podávaných léčiv, tedy například injekcí, infuzí, biologických léčiv, některých produktů buněčné a genové terapie a dalších sterilních přípravků. Významné je také u některých zdravotnických prostředků, zejména pokud přicházejí do kontaktu s krví, mozkomíšním mokem nebo sterilními tkáněmi.

Proč je riziko nejvyšší u parenterálních přípravků

U perorálně podávaných přípravků prochází látka trávicím traktem, který představuje určitou přirozenou bariéru. Naproti tomu parenterální přípravky tuto bariéru obcházejí. Pokud by takový produkt obsahoval endotoxiny, mohou se dostat přímo do krevního oběhu nebo do citlivých tkání.

Z tohoto důvodu jsou požadavky na sterilitu a kontrolu endotoxinů u parenterálních přípravků výrazně přísnější. Endotoxinový limit se stanovuje s ohledem na cestu podání, maximální dávku přípravku a tělesnou hmotnost pacienta. Zvlášť přísné limity platí například pro intratekální podání, tedy podání do prostoru s mozkomíšním mokem.

Kde mohou endotoxiny vzniknout nebo se objevit během výroby

Bakteriální endotoxiny nevznikají chemickou reakcí při výrobě samotné, ale pocházejí z gramnegativních bakterií. Do výrobního procesu se mohou dostat kontaminací surovin, vody, pomocných látek, výrobního prostředí, zařízení nebo obalových materiálů.

Typickým zdrojem může být voda používaná ve výrobě, například voda pro injekce, čištěná voda nebo voda použitá při oplachu zařízení a komponent. Voda je z hlediska endotoxinů kritická, protože gramnegativní bakterie mohou přežívat nebo se množit ve vodních systémech, biofilmech, potrubí, zásobnících nebo na vlhkých površích.

Dalším zdrojem mohou být vstupní suroviny a pomocné látky, zejména pokud nejsou dostatečně kontrolovány z hlediska mikrobiální čistoty. U biologických a biotechnologických produktů mohou být rizikové také kultivační média, pufry, roztoky, enzymy, proteiny, nukleové kyseliny, vektory, plazmidy nebo jiné materiály používané při výrobě.

Endotoxiny se mohou do procesu dostat také přes výrobní zařízení, hadičky, filtry, nádoby, jednorázové komponenty, uzávěry, vialky nebo jiné kontaktní materiály. Riziko je vyšší tam, kde dochází ke kontaktu produktu s vodnými roztoky nebo kde se používají materiály, které nebyly vhodně kvalifikovány pro endotoxinové testování.

Významným rizikem jsou také biofilmy. Ty se mohou vytvářet ve vodních systémech, potrubí nebo na vnitřních površích zařízení. I když jsou bakterie následně odstraněny nebo usmrceny, endotoxiny mohou v systému přetrvávat, protože jsou relativně tepelně stabilní a nemusí být odstraněny běžnou sterilizací.

Rozdíl mezi sterilitou a nepřítomností endotoxinů

Důležité je rozlišovat mezi sterilitou a nízkým obsahem endotoxinů. Sterilní produkt neobsahuje životaschopné mikroorganismy. To však automaticky neznamená, že neobsahuje endotoxiny.

Endotoxiny mohou zůstat přítomné i po usmrcení bakterií. Proto samotná sterilizace nemusí stačit k zajištění endotoxinové bezpečnosti produktu. Z tohoto důvodu je nutné endotoxiny specificky testovat a kontrolovat v rámci výrobního procesu i u finálního produktu.

Metody detekce endotoxinů

Testy Limulus Amebocyte Lysate (LAL) jsou v současnosti jednou z nejčastěji používaných metod pro detekci bakteriálních endotoxinů. Jsou založeny na reakci amébocytů kraba ostrorepa, což jsou specializované imunitní buňky, které při kontaktu s endotoxiny aktivují koagulační kaskádu. Tento mechanismus byl využit a LAL test byl uveden na trh před více než 50 lety.

Kromě tradičních LAL metod se stále více využívají také rekombinantní alternativy, například rFC assay založený na recombinant Factor C. Tyto metody umožňují detekci endotoxinů bez použití surovin získaných z krve krabů ostrorepů a představují udržitelnější, animal-free alternativu.

Porovnání detekce endotoxinu metodami rFC a LAL

Byla provedena odborná studie, která porovnávala rekombinantní metodu rFC s tradičně používanými metodami LAL a TAL pro detekci bakteriálních endotoxinů. Cílem bylo ověřit, zda metoda rFC poskytuje srovnatelné výsledky jako standardní LAL/TAL testy a zda může představovat vhodnou alternativu pro rutinní endotoxinové testování.

Studie ukázala, že metoda rFC dosahuje při detekci bakteriálních endotoxinů srovnatelných výsledků jako tradiční LAL metody. Výsledky z publikovaných studií prokázaly dobrou korelaci mezi rFC a LAL u různých typů vzorků. rFC tak představuje vhodnou alternativu k LAL, zejména díky tomu, že nevyužívá materiál živočišného původu a může přinést etické i ekologické výhody.

Podrobnosti najdete ZDE.

Udržitelnost a ochrana krabů ostrorepů

Krabi ostrorepi jsou dlouhodobě využíváni nejen pro získávání suroviny pro LAL testy, ale také jako návnada pro komerční rybolov. Ve Spojených státech jsou proto již od roku 1998 zavedeny rybolovné kvóty prostřednictvím Komise pro mořský rybolov atlantských států USA ASMFC a na ochraně populace se podílejí také neziskové organizace, například skupina pro ekologický výzkum a vývoj ERDG. Díky těmto opatřením byl stav populace atlantického kraba ostrorepa v roce 2019 hodnocen jako dobrý nebo neutrální. Odlišná situace je však v Asii, kde podobné regulace často chybějí a populace ostrorepů jsou výrazně ohroženy nejen rybolovem, ale také ničením a znečištěním jejich přirozených ekosystémů. Rostoucí potřeba endotoxinových testů navíc zvyšuje tlak na dostupný zdroj amebocyte lysate, který se do budoucna může stát omezeným. To podporuje význam zavádění udržitelnějších, animal-free alternativ, jako je například rFC metoda.

Potřeba přechodu na animal-free metody

Průmysl si uvědomil potřebu změnit svůj přístup a ve větší míře zavádět udržitelnější, animal-free metody testování endotoxinů, které neovlivňují kraby ostrorepy ani širší ekosystém, ve kterém hrají klíčovou roli.

Taková změna může trvat delší dobu a v krátkodobém horizontu může vyžadovat významné investice. Tyto počáteční náklady však mohou být překonány dlouhodobými přínosy.

PyroGene® Assay jako udržitelná alternativa

Jednou z udržitelných a animal-free metod testování endotoxinů je PyroGene® Assay založený na recombinant Factor C.

Společnost Lonza včas rozpoznala potřebu alternativy a vyvinula tento kit zhruba před 15 lety. Společnosti již začaly tuto metodu zavádět a v září 2018 byl nový lék společnosti Eli Lilly, Emgality™ (galcanezumab), prvním lékem schváleným americkou FDA, který používá rFC assay místo metody založené na LAL.

Recombinant Factor C assay, konkrétně PyroGene® rFC od společnosti Lonza, je regulačně akceptovanou alternativou k tradičním LAL metodám pro detekci bakteriálních endotoxinů. rFC reagencie jsou vyráběny ve stejném FDA licencovaném zařízení jako LAL produkty a jejich použití bylo podpořeno regulační dokumentací Lonza Master File.

Více se dočtete v tomto odkazu.

Praktická doporučení při testováni endotoxinů

• Zvažovat rFC jako alternativu k LAL metodám
  Rekombinantní metoda rFC poskytuje podle publikovaných dat srovnatelné výsledky jako tradiční LAL metody a zároveň nevyužívá suroviny živočišného původu.
• Při porovnávání metod dbát na správný design studie
  Výsledky endotoxinových testů mohou být ovlivněny teplotou, dobou míchání, operátorem, ředěním vzorku nebo velmi nízkou hladinou detekovaného endotoxinu. Proto je důležité testy provádět za dobře kontrolovaných podmínek.
• Zohlednit možné interference vzorku
  Každý vzorek, který není LAL Reagent Water (LRW), může s testem interferovat. Interference se může projevit jako falešně negativní výsledek, tedy inhibice, nebo jako falešně pozitivní výsledek, tedy enhancement.
• Vždy používat Positive Product Control (PPC)
  PPC pomáhá ověřit, zda testovaný vzorek neinhibuje nebo naopak nezvyšuje výsledek endotoxinového testu. Přijatelná hodnota PPC je obvykle v rozmezí 50–200 %.
• U vzorků obsahujících beta-glukany zvážit rFC metodu
  Beta-glukany mohou u LAL testů způsobovat falešně pozitivní aktivaci. rFC metoda je v tomto ohledu specifičtější, protože je zaměřena na endotoxinovou dráhu přes recombinant Factor C.
• U krevních vzorků počítat s výraznou interferencí
  Plná krev, sérum i plazma mohou obsahovat proteiny, antikoagulancia nebo další složky, které ovlivňují detekci endotoxinů. Proto je vhodné optimalizovat přípravu vzorku.
• U krevních vzorků zvážit tepelnou úpravu nebo dispergační činidlo
  Proteiny, například albumin, mohou endotoxin maskovat. Tepelná úprava nebo použití dispergačního činidla, například PYROSPERSE® Dispersing Agent, může pomoci endotoxin uvolnit. Po PyroGene kit nás kontaktujte pro doporučení vhodného dispergačního činidla
• Při tepelné úpravě zahrnout „hard spike“
  Známé množství endotoxinu by mělo být přidáno před tepelnou úpravou, aby bylo možné ověřit, že samotná úprava nevede ke ztrátě endotoxinu.
• U vzorků s antikoagulancii zvážit přidání MgCl₂
  Antikoagulancia, například heparin, mohou interferovat s LAL enzymy vazbou dvojmocných kationtů. Přidání MgCl₂ může tuto interferenci pomoci překonat.
• U ATMP produktů, tedy léčivých přípravků pro moderní terapii, testovat endotoxiny nejen ve finálním produktu
  U produktů buněčné a genové terapie je vhodné sledovat endotoxiny také v průběhu výroby, v surovinách, vektorech, plazmidech, médiích a dalších materiálech používaných při procesu.
• Používat příslušenství vhodné pro endotoxinové testování
  Označení „pyrogen-free“ nebo „endotoxin-free“ nemusí vždy znamenat, že je materiál vhodný pro konkrétní endotoxinový test. Je nutné ověřit nízký obsah endotoxinu i absenci interference s testem.
• Validovat skladování vzorků před testováním
  Pokud se vzorky před endotoxinovým testem zmrazují nebo delší dobu skladují, je nutné ověřit, že skladovací podmínky neovlivní obsah endotoxinu. Jinak hrozí falešně nízký nebo falešně negativní výsledek.
• Při testování nových nebo nestandardních vzorků nejprve zvolit vhodný test
  Výběr metody by měl vycházet z požadované citlivosti, dostupného vybavení, očekávaných interferencí vzorku a rozpočtu.
• U neznámých vzorků začít screeningem ředění
  Ředění v LRW může pomoci překonat mnoho interferencí. Je však nutné hlídat Maximum Valid Dilution (MVD), aby endotoxin nebyl zředěn pod mez detekce.
• U nerozpustných vzorků použít extrakční přístup
  Nerozpustné vzorky nebo zdravotnické prostředky lze ponořit, opláchnout, propláchnout nebo extrahovat v LRW a následně testovat extrakt.
• Stanovit vhodný endotoxinový limit
  U jedinečných vzorků, které nemají kompendiálně stanovený limit, je nutné limit určit v rámci validace a s ohledem na typ produktu, způsob použití a riziko pro pacienta.

Často kladené dotazy (FAQ)

1. Co jsou endotoxiny a proč jsou nebezpečné?

Endotoxiny jsou složky vnější membrány gramnegativních bakterií. Pokud se dostanou do lidského organismu, mohou vyvolat horečku, zimnici, zánětlivou reakci a v závažných případech i septický šok.

2. Proč je testování endotoxinů důležité u parenterálních přípravků?

Parenterální přípravky obcházejí přirozenou bariéru trávicího traktu. Pokud by obsahovaly endotoxiny, mohou se dostat přímo do krevního oběhu nebo citlivých tkání.

3. Znamená sterilní produkt automaticky, že neobsahuje endotoxiny?

Ne. Sterilní produkt neobsahuje životaschopné mikroorganismy, ale endotoxiny v něm mohou zůstat přítomné i po sterilizaci.

4. Jaký je rozdíl mezi LAL a rFC metodou?

LAL testy využívají surovinu získanou z krve krabů ostrorepů. rFC metoda je rekombinantní alternativa založená na recombinant Factor C a nevyužívá materiál živočišného původu.

5. Proč se stále více mluví o animal-free testování endotoxinů?

Protože tradiční LAL metody jsou spojené s využíváním krabů ostrorepů. Animal-free metody, jako rFC, představují udržitelnější a etičtější alternativu.

6. Co je PyroGene® Assay?

PyroGene® Assay je test endotoxinů založený na recombinant Factor C. Slouží jako udržitelná alternativa k tradičním LAL metodám.

7. Kdy je vhodné zvážit použití rFC metody?

rFC metodu je vhodné zvážit zejména tehdy, když laboratoř hledá animal-free řešení, chce omezit riziko interference beta-glukanů nebo přejít na udržitelnější způsob testování.

8. Co je Positive Product Control a proč se používá?

Positive Product Control ověřuje, zda testovaný vzorek neinhibuje nebo naopak nezvyšuje reakci endotoxinového testu. Pomáhá potvrdit spolehlivost výsledku.

9. Jaké vzorky mohou při testování endotoxinů interferovat?

Interferovat mohou například krevní vzorky, sérum, plazma, vzorky s proteiny, antikoagulancii, beta-glukany nebo složité biologické matrice.

10. Proč je důležité validovat skladování vzorků před testováním?

Protože zmrazování, dlouhodobé skladování nebo nevhodné podmínky mohou ovlivnit měřitelný obsah endotoxinu a vést k falešně nízkým nebo falešně negativním výsledkům.