NGS oligos – Vysoce čisté oligonukleotidy pro Next-Generation Sequencing

Jaké vlastnosti jsou dnes klíčové pro NGS oligonukleotidy? NGS oligonukleotidy patří mezi základní komponenty přípravy knihoven pro sekvenování nové generace a jejich kvalita přímo ovlivňuje výkon NGS aplikací. Metabion NGS oligos jsou navrženy s důrazem na vysokou čistotu, eliminaci křížové kontaminace a konzistentní kvalitu.

NGS oligos od Metabionu jsou navrženy tak, aby splňovaly náročné požadavky aplikací sekvenování nové generace (NGS). Díky čistotě třídy NGS a specializované syntéze minimalizují křížovou kontaminaci a zajišťují vysoký výkon v sekvenačních experimentech.

Proč zvolit metabion NGS oligos?

Kvalita vstupních oligonukleotidů je pro úspěch NGS klíčová. Metabion proto vyvinul speciální syntetickou linku, která zaručuje, že oliga neobsahují křížové kontaminace a poskytují tak spolehlivé výsledky.

Hlavní výhody

Vysoká čistota a výkon – optimalizované pro všechny běžné NGS platformy.
Specializovaný syntetický proces – eliminuje riziko křížové kontaminace.
Optimalizovaný poměr cena / výkon – vysoká kvalita při výhodné ceně.
100 % kontrola kvality – každý primer je potvrzen dokumentovanou analýzou ESI-ToF (včetně spekter).

Přehled portfolia

NGS oligos jsou dodávány ve standardních škálách podle množství (v nmol) a mají fixní cenu pro nemodifikované délky oligonukleotidů (11–40 a 41–80 bazí), s možností volit specifické modifikace podle vaší aplikace.

přehled portfolia ngs oligo.png

Využití v praxi

NGS oligos se používají pro přípravu DNA knihoven a další NGS aplikace, kde je kritická spolehlivost, reprodukovatelnost a přesnost sekvenační analýzy.

Často kladené dotazy

1/ Jak mohu objednat NGS oligonukleotidy?

NGS oligonukleotidy lze objednat prostřednictvím objednávkového formuláře ve formátu Excel. Do tabulky vyplňte požadované sekvence, množství, případné modifikace a další specifikace a vyplněný soubor následně odešlete na e-mail objednavky@easport.cz.

Objednávejte ZDE.

2/ Jak se vyrábějí NGS oligonukleotidy?

Metabion vyrábí NGS oligonukleotidy ve specializovaném syntetickém procesu. Ten výrazně minimalizuje riziko křížové kontaminace a zaručuje mimořádně vysokou kvalitu. S NGS oligos od Metabionu můžete provádět experimenty sekvenování nové generace s jistotou, že pracujete s reagencii, na které se můžete spolehnout.

Oligonukleotidy jsou syntetizovány pomocí DNA syntetizátoru, což je v podstatě počítačem řízený systém pro dávkování reagencií. První báze je navázána na pevný nosič, obvykle skleněnou nebo polystyrenovou kuličku, která slouží k ukotvení rostoucího řetězce DNA v reakční koloně. Syntéza DNA se skládá ze série chemických reakcí.

I Odblokování (Deblocking)
První báze, navázaná na pevný nosič prostřednictvím chemického linkeru, je deprotektována odstraněním ochranné skupiny (tritylové skupiny). Tím vzniká volná 5´-OH skupina, která může reagovat s následující bází.

II Navázání (Coupling)
Následující báze je aktivována a naváže se na 5´-OH skupinu poslední báze v řetězci.

III Zablokování neúspěšných reakcí (Capping)
Všechny první báze, které se nepodařilo navázat, jsou zablokovány. Tyto neúspěšné báze se již dále neúčastní syntetického cyklu.

IV Oxidace (Oxidation)
Vazba mezi první bází a úspěšně navázanou druhou bází je oxidována, čímž se stabilizuje rostoucí řetězec.

V (= I) Odblokování (Deblocking)
Z nově přidané báze je odstraněna 5´ tritylová skupina.

Každý reakční cyklus vede k přidání jedné DNA báze. Opakováním syntetických cyklů lze vytvořit řetězec DNA o požadované délce.

3/ Jakou dokumentaci obdržíte k NGS oligonukleotidům?

Štítek na zkumavce s oligonukleotidem obsahuje základní informace, jako je název oliga, jméno objednávající osoby, sekvence oligonukleotidu včetně modifikací, ID oliga, množství DNA (OD260 a nmol), teplota tání (Tm) a molekulová hmotnost.

Kromě toho obdržíte technický datový list s podrobnějšími informacemi o fyzikálně-chemických vlastnostech oligonukleotidu, například o složení bází, počtu bází, stupni purifikace, množství DNA (OD260 a nmol), teplotě tání (Tm) a molekulové hmotnosti. Součástí dodávky je rovněž výtisk dokumentace hmotnostní kontroly (Mass-Check), včetně spektra.

Pro rozlišení nabízených možností kontroly kvality (QC) a rozsahu příslušné dokumentace, uvedeného v objednávkových formulářích a v doprovodných dokumentech dodávaných s produkty, je používána následující terminologie:

Mass Check

Standardní kontrola kvality prováděná u každého jednotlivého oligonukleotidu. Používá se metoda MALDI-ToF nebo ESI-ToF v závislosti na povaze oligonukleotidu a interních postupech společnosti Metabion. Tato služba je poskytována bez příplatku a není k ní dodávána tištěná ani PDF dokumentace. NGS oligonukleotidy jsou vždy dodávány včetně spekter hmotnostní kontroly.

Mass Check + analytická HPLC

Explicitně objednaná a provedená kontrola Mass Check (MALDI-ToF nebo ESI-ToF v závislosti na povaze oligonukleotidu a interních postupech společnosti Metabion) spolu s analytickou HPLC (viz FAQ „Jaký je rozdíl mezi preparativní a analytickou HPLC?“). Produkt je dodáván včetně spekter analytické HPLC a hmotnostní spektrometrie. Tato služba je zpoplatněna.

4/ Po použití primerů Metabion pro NGS sekvenování jsem zjistil(a), že sekvence odpovídající primeru není totožná se sekvencí primeru, kterou jsem objednal(a). Proč?

Vkládání bází je připisováno malému množství detritylovaného amiditu přítomného během kroku navázání (coupling), zatímco delece jsou pravděpodobně způsobeny neúspěšnými sekvencemi, které nebyly zablokovány (capped) a byly následně prodlouženy.

Přesvědčivějším vysvětlením pozorovaných změn sekvence je však neúplná deprotekce oligonukleotidu. Pokud oligonukleotid nese ochrannou skupinu na jedné nebo více pozicích, je tato ochrana přenesena do následného PCR produktu, který je poté transformován do E. coli. Hostitelský systém opravy chyb párování (mismatch repair) se zde pravděpodobně pokusí tuto anomálii opravit dosazením báze, která však nemusí být správná.

Nejpravděpodobnější příčinou neúplné deprotekce jsou deoxyguanosiny chráněné isobutyrylovou skupinou (isobutyryl-protected dG), jejichž ochranné skupiny se odstraňují nejobtížněji.

Obecně platí, že čím delší je oligonukleotid, tím vyšší je pravděpodobnost vedlejších reakcí během syntézy, stejně jako riziko neúplné deprotekce. Mezi možné zdroje vedlejších reakcí vedoucích ke vzniku neúspěšných produktů patří depurinace (která postihuje především bázi A) a tvorba sekundárních struktur daná sekvencí oligonukleotidu. Tyto jevy nelze zcela vyloučit. Společnost Metabion se je však snaží minimalizovat průběžnou optimalizací syntetických a purifikačních protokolů.

5/ Mají mé oligonukleotidy fosfát na 5´ konci?

Pokud není fosforylace výslovně objednána, jsou oligonukleotidy syntetizovány bez fosfátu na 3´ i 5´ konci. Fosfát na 5´ a/nebo 3´ konci je k dispozici jako volitelná modifikace za příplatek.

6/ Jaká je maximální délka DNA oligonukleotidu, kterou lze syntetizovat?

Skutečné omezení spočívá v rozlišovací schopnosti použité purifikační metody a v účinnosti navázání (coupling efficiency) DNA syntetizátoru. Jsme schopni syntetizovat DNA oligonukleotidy o délce až 220 bází a pomocí HPLC purifikace získat dostatečné množství pro úspěšnou konstrukci genů. Je však třeba mít na paměti, že s rostoucí délkou oligonukleotidu se zvyšuje pravděpodobnost kumulace sekvenčních chyb.

Účinnost navázání je hlavním faktorem, který ovlivňuje maximální délku syntetizovatelné DNA. Dalšími přispívajícími faktory jsou složení bází a zvolená syntetická škála. Podrobnější informace o účinnosti navázání naleznete v FAQ „Co je účinnost navázání (coupling efficiency)?“.

Důležité je, že u delších oligonukleotidů dramaticky roste pravděpodobnost předčasného přerušení syntézy v důsledku nedostatečné účinnosti navázání nukleotidů. Syntéza speciálních „dlouhých oligonukleotidů“ navíc vyžaduje větší množství vstupních materiálů, jako jsou amidity a roztoky, které je nutné používat ve vyšším nadbytku.

Vzhledem k našim rozsáhlým zkušenostem se syntézou velmi dlouhých oligonukleotidů se neváhejte obrátit na naše specialisty a konzultovat s nimi své projekty.

7/ Jaká doporučení je vhodné zohlednit při návrhu oligonukleotidů?

Délka sekvence

Společnost Metabion běžně syntetizuje DNA oligonukleotidy o délce od 5 do 220 bází. Většina sekvencí má délku 18–30 bází, s průměrem kolem 24 bází. Je třeba mít na paměti, že s rostoucí délkou oligonukleotidu klesá podíl plnohodnotného produktu v surové syntéze, což vede k nižším výtěžkům po purifikaci.

Složení sekvence

Ujistěte se, že sekvence neobsahuje oblasti schopné tvořit vlásenkové struktury (hairpins) ani samokomplementární úseky. Problémem může být také výskyt více než šesti stejných po sobě jdoucích bází (např. GGGGGGG), které mohou snížit výsledný výtěžek.

Umístění modifikací

Pokud je to možné, umisťujte modifikace na 5´ konec oligonukleotidu. Automatizovaná syntéza DNA probíhá ve směru od 3´ ke 5´ konci a každý krok navázání nukleotidu má účinnost nižší než 100 %. To znamená, že v každém kroku vzniká malé množství zkrácených a zablokovaných (capped) produktů. Umístění modifikace na 5´ konec zajišťuje, že modifikován je pouze oligonukleotid plné délky. Navíc je většina modifikací hydrofobnější než nemodifikované oligonukleotidy, takže plnohodnotný modifikovaný oligonukleotid se při HPLC purifikaci silněji váže na reverzní fázi, což zlepšuje separaci od zkrácených, nemodifikovaných sekvencí.

Syntetická škála

Termín „syntetická škála“ označuje množství derivatizovaného pevného nosiče použitého při syntéze. Konečné dodané množství produktu závisí na délce sekvence, její sekundární struktuře, typu použité modifikace, umístění modifikace, počtu modifikací na oligonukleotid a zvolené purifikační metodě.

Metoda purifikace

Metodu purifikace volte podle požadovaného stupně čistoty pro vaši konkrétní aplikaci.

Oligo objednávky