siTOOLs - komplexní pooly pro depleci rRNA a RNAi

siTOOLs je německá firma, jejíž výrobky jsou určené všem vědcům, kteří se zabývají regulací genové exprese, studiem funkce proteinů nebo transkriptomikou. V následujícím článku vám představíme principy základních produktových řad siTOOLs.

siTOOLs je německá firma z Mnichova, jejíž výrobky jsou určené všem výzkumníkům, kteří se zabývají regulací genové exprese, studiem funkce proteinů nebo transkriptomikou. V následujícím článku vám představíme nejdůležitější produkty siTOOLs a jejich principy. Pokud Vás jejich řešení pro RNAi nebo RNA pulldown zaujme, rádi vám poskytneme další informaci související s Vaší konkrétní aplikaci.

siPOOLs – komplexní pooly siRNA pro spolehlivé vyřazení genů

RNA interference (RNAi) je proces, při kterém interferují nekódující molekuly RNA (siRNA, miRNA) s cílovými úseky mRNA a v důsledku této vazby dochází k zabránění genové exprese. Jedná se o běžný jev v eukaryotických buňkách, který se experimentální biologové naučili využívat k cílenému vyřazování genů. RNAi má několik výhod. Jedná se o jednoduchou metodu, která může dosahovat vysoké účinnosti a lze snadno použít pro různé typy buněk. Práce s siRNA je velmi jednoduchá a základní principy jsou podobní jako při treatování buněk malými organickými molekulami. Během experimentů stačí transfekovat siRNA do buněk pomocí běžných lipofekčních činidel (např. Fugene HD). Běžně používané reagenty pro RNAi většinou obsahují 1-4 různé sekvence siRNA cílící na jeden gen v poměrně vysoké nM koncentraci. Pokud jsou jednotlivé siRNA v příliš vysoké koncentraci, může dojít k nespecifické vazbě a nežádoucím off-target efektům. Často také poskytují proměnlivou účinnost, což omezuje jejich použitelnost v experimentech.

Princip fungování siPOOLsObr. 1 Srovnání běžných siRNA s komplexními siPOOLy od firmy siTOOLs. Při použití malého počtu siRNA ve vysoké koncentraci dochází k nespecifické vazbě i na jiné než cílové sekvence. Komplexní pooly 30 oligonukleotidů v pikomolární koncentraci se váží specificky bez off-target efektů a nijak neovlivňují fenotyp vašich buněk.

 

Pokud se chcete vyhnout složitým validacím vaší siRNA a opakování experimentů s různými siRNA, vyzkoušejte poolovanou siRNA od siTOOLs. siPOOLy řeší tyto nežádoucí off-target efekty pomocí tzv. „pack hunter“ přístupu. Pro vyřazení genů jsou místo klasických poolů 4 siRNA použity komplexní pooly 30 optimálně navržených oligonukleotidů. Ty jsou navíc zředěny na pikomolární koncentraci, při které nedochází ke stimulaci fenotypů a nespecifické vazbě na jiné sekvence. Dochází čistě ke specifickému vyřazení cílového genu. Sekvence jednotlivých siRNA v poolu jsou optimalizovány, aby maximálně pokrývaly celou sekvenci transkriptu a účinně hybridizovaly a jsou také filtrovány proti paralogům, což umožňuje velice účinný a specifický knockdown genů (pro více informací si můžete přečíst článek Hannus et al., 2014). siPOOLy lze použít proti kódujícím RNA i dlouhým nekódujícím RNA, vybraným isoformám nebo blízce příbuzným genům a mohou být použity i v kombinaci ke studiu synergických interakcí genů.

Kromě experimentálních benefitů jsou pooly výhodnější také po ekonomické stránce. Nákup jednoho komplexního poolu je totiž finančně výhodnější než nákup několika jednotlivých siRNA a zajistí neprůstřelnost experimentů z pohledu recenzentů při publikaci článků. siPOOLy cílené na několik tisíc nejčastěji silencovaných mRNA jsou ihned připravené k odeslání a je možné navrhnout pooly i proti méně častým transkriptům, pokud je dostupná jejich sekvence v některé z databází. Tato technologie je ideální i pro screeningové projekty, protože experimenty s siRNA lze provádět i v high-throughut formátu. Off-target efekty mohou snadno přivést váš výzkum do slepé uličky a dostat se zpět na správnou cestu stojí spoustu času a peněz. Investice do patentované technologie siPOOLs se určitě vyplatí.

riboPOOLs – flexibilní řešení pro ribozomální depleci

Jedním z důležitých kroku při sekvenování RNA je bezpochyby izolace celkové RNA a následné odstranění kontaminující ribozomální rRNA. Ta většinou tvoří 80-90 % transkriptomu a její účinné odstranění je kritické pro získání kvalitních dat. Pokud hledáte elegantní způsob, jak se rRNA zbavit, vyzkoušejte riboPOOLy.

deplece lidské rRNA pomocí Human riboPOOL

Obr. 2 Srovnání deplece vzorku lidské RNA pomocí riboPOOLu od siTOOLS a konkurenčního Ribo-Zero. Human riboPOOL odstranil 98,6 % kontaminující rRNA, konkurenční Ribo-Zero jen 80,6 %.

Podobně jako u siPOOLs se i v tomto případě jedná o komplexní směsi biotinylovaných oligonukleotidů. Tentokrát jsou směsi ještě komplexnější a obsahují 60-350 oligonukleotidů, které pokrývají celé sekvence rRNA jednotlivých ribozomálních podjednotek. Díky vysokému počtu různých sekvencí lze opět výrazně snížit koncentraci jednotlivých oligonukleotidů a minimalizovat tak nespecifickou vazbu. Tento přístup zajišťuje robustní purifikaci s vysokou specifitou a účinností odstranění >95 % rRNA. Výhodou tohoto přístupu je, že lze kromě mRNA použít i pro analýzu RNA bez poly(A) konce, jako jsou nekódující RNA, histonová RNA nebo prokaryotická RNA. Celá purifikace je velmi rychlá a zabere pouhých 70 minut. V prvním kroku se celková izolovaná RNA inkubuje s riboPOOLem. Po hybridizaci rRNA a oligonukleotidů se oligo-rRNA komplex zachytí na streptavidinové kolonce nebo magnetických částicích a ostatní RNA zůstane v roztoku.

postup deplece rRNA pomocí riboPOOLObr. 3 Postup ribozomální deplece pomocí riboPOOL kitů od siTOOLs.

Vzhledem k rozdílům ve struktuře rRNA mezi jednotlivými skupinami organismů není možné použít jeden kit univerzálně na všechny druhy. Nabídka kitů už je ale poměrně široká a neustále se rozšiřuje. Dostupné jsou jak druhově specifické kity pro běžně používané modelové organismy, tak i pro celé skupiny organismů. Druhově specifické pooly jsou navrženy tak, že cílí na konzervované i nekonzervované oblasti rRNA, a dosahují nejvyšší účinnosti deplece (až 99 %). Pan-riboPOOLy pro skupiny organismů jsou pak ideální volbou pro jednoduché multitranskriptomické studie, případně pokud pracujete s více druhy ze stejné fylogenetické skupiny (bakterie, houby, savci aj.). RiboPOOLy je možné i kombinovat a použít je pro analýzu smíšených vzorků (nakažená tkáň, krev, environmentální vzorky). Princip riboPOOL lze adaptovat i pro odstranění jiných abundantní RNA a jsou dostupné i kity např. pro odstranění globinové RNA z krevních vzorků nebo pro odstranění RNA viru SARS-CoV-2 při studiu genové exprese nakažených buněk.

Také je možné využít speciální kity pro analýzu degradovaných vzorků izolovaných z FFPE. Díky překrývajícím se oligonukleotidům, které pokrývají celou sekvenci rRNA, lze velmi účinně odstranit degradované fragmenty rRNA a vytěžit ze vzorku zbývající intaktní RNA. Kompletní seznam dostupných kitů je uveden v přiložené tabulce. Pokud není Váš požadovaný organismus nebo skupina organismů v nabídce, je možné připravit i riboPOOL na míru, pokud znáte sekvence rRNA Vašeho organismu.

FFPE riboPOOLObr. 4 Data z Bioanalyzeru ukazující poměr degradované a intaktní RNA izolované z FFPE vzorku.

raPOOL - studium interakcí RNA

Zajímají vás interakce Vaší oblíbené RNA s dalšími nukleovými kyselinami a proteiny? raPOOLy umožňují afinitní purifikaci libovolné mRNA nebo lncRNA, které tvoří komplexy s RNA-vazebnými proteiny a nukleovými kyselinami. Při použití raPOOLů se nejprve vaše RNA crosslinkuje in vivo s interagujícím proteinem nebo nukleovou kyselinou. Následně se přidá raPOOL obsahující biotinylované oligonukleotidy, které se specificky naváží na vaši požadovanou RNA a izolují celý komplex z roztoku pomocí streptavidinových magnetických částic. V posledním kroku se pak RNA i interagující molekuly eluují z povrchu částic a lze je analyzovat pomocí dalších technik, jako je RNAseq nebo analýza pomocí hmotnostní spektrometrie. Díky této optimálně navržené směsi DNA oligonukleotidů docílíte až stonásobného obohacení vaší cílové RNA.

rna_affinity_workflow.jpg

Obr. 5 Postup izolace RNA v komplexu pomocí raPOOLs od firmy siTOOLs.

Servis

Kromě výroby kitů nabízí siTOOLs i možnost outsourcingu RNAi screeningu nebo RNA-seq experimentů. Pokud nejste experty na tuto problematiku, může být outsourcing efektivním řešením pro získání dalších experimentálních dat pro vaše publikace. Budete mít jistotu, že dostanete výsledky v řádném termínu, správně vyhodnocené a pečlivě zdokumentované.

Další informace o produktech z nabídky siTOOLs můžete získat také ze záznamu našeho webináře pořádaného ve spolupráci s siTOOLs. Produktům siTOOLs můžete věřit, používají je nejen vědci z akademických institucí, ale i firmy jako Roche, J&J nebo Bayer, což svědčí o vysokém standardu kvality.

Kontaktujte nás

Rychlý kontakt: Ing. Vojtěch Ledvina, Ph.D. +420 725 320 796, vojtech.ledvina@eastport.cz