Spokojené buňky – podmínka pro úspěšné buněčné eseje a mikroskopii
Mikroskopická videa a fotografie z experimentů s živými buňkami poskytují zcela odlišný pohled na vaše experimenty. Možnost sledovat buněčné kultury v průběhu času poskytuje skvělý vhled do jejich fyziologie a funkce. Často je ale otázkou, jaký typ mikroskopu je vhodný pro danou aplikaci. Nejen o této problematice se dozvíte více z našeho článku.
Spokojené buňky – nutná podmínka pro úspěšné buněčné eseje a mikroskopii
Pro získání použitelných a reprodukovatelných dat a výsledků z buněčných esejí je klíčové používat jen buňky v dobré kondici. Doporučujeme si proto nastavit pro vaše buněčné kultury standardní postupy, které zaručí, že minimalizujete proměnlivost v množství a kvalitě buněk mezi jednotlivými experimenty. Pokud budete pasážovat buňky včas, ve stejných intervalech a vždy ředit na stejnou hustotu, omezíte tento potenciální zdroj variability dat na minimum. Důležité je také používat kvalitní kultivační média s přísně kontrolovaným složením a minimálními rozdíly mezi šaržemi. Tím zajistíte stabilní metabolismus buněk, expresi proteinů a viabilitu a budete mít jistotu, že sledujete opravdu jen vliv vašeho treatmentu. Buňky je vhodné také pravidelně testovat na přítomnost mykoplazmat. Ty mohou díky své malé velikosti do 1 µm velmi snadno uniknout vašemu zraku i pod mikroskopem a působit nemalé potíže při experimentech. Z těch "méně" závažných problémů může docházet ke změnám v metabolických drahách nebo profilu exprimovaných proteinů. V extrémních případech může ale docházet i k chromozomálním aberacím, případně smrti vašich buněčných kultur.Při dodržování uvedených postupů je možné následně získat konzistentní data prostřednictvím buněčných esejí. Ty většinou umožňují měření jen omezeného počtu parametrů, který je dán nutností používat spektrálně kompatibilní fluorofory a luminiscenční reportéry.
Zcela odlišný pohled na experimenty přináší časosběrná mikroskopická videa. Možnost sledovat buněčné kultury v průběhu času poskytuje skvělý vhled do jejich fyziologie a funkce. Mikroskopy pro zobrazování živých buněk otevírají nové možnosti studia buněčného zdraví, viability, tvorby kolonií, migrace a buněčných reakcí na vnější podněty. Zobrazování umožňuje výzkumníkům zjistit nejen to, zda, ale také jak a kdy dochází k určitým biologickým dějům v buněčné kultuře.
Aplikace kinetických fluorescenčních esejí
Ve spojitosti s mikroskopií buněk se často setkáváme s používáním geneticky kódovaných fluorescenčních proteinů nebo syntetických fluorescenčních značek, které poskytují cenné informace o expresi sledovaných proteinů nebo molekulových interakcích. Fluorescenční zobrazování živých buněk se stává stále cennějším i v oblastech jako je vývoj léků, tkáňové inženýrství, imunologie, imunoterapie a výzkum rakoviny. Z fluorescenčních barviv a jejich podrobné kinetické vizualizace mohou vědci těžit v různých aplikacích, jako je sledování životaschopnosti buněk, stanovení účinnosti transfekce, ko-kultivace a další analýza buněčných procesů (viz tabulka).
|
Oblast výzkumu → Aplikace ↓ |
Vývoj léčiv | Tkáňové inženýrství | Sledování imunitní odpovědi | Výzkum rakoviny |
| Buněčná viabilita | Zkoumání vlivu léků na životaschopnost buněk | Zkoumání životaschopnosti (3D) buněčného modelu | Studování vlivu infekcí na životaschopnost imunitních buněk | Testování míry přežití rakovinných buněk v závislosti na koncetraci léčiva |
| Transfekce | Zkoumání účinku léků na specifické geny | Rozlišování různých druhů buněk v konstruktech (oblast tkáňového inženýrství) | Sledování vlivu určitých genů na imunitní odpověď organismu |
Zkoumání vliv určitých genů na vývoj rakoviny |
| Ko-kultivace | Testování zmírňujících nebo inhibičních účinků léků na jiné buňky | Sledování vývoje krevních cév v konstruktu | Zkoumání reakcí mezi imunitními a epitelovými buňkami během infekce | Studování vlivu imunitních buněk na životaschopnost rakovinných buněk |
| Buněčné procesy a interakce |
Studování morfologických změn vyvolaných léčivem |
Sledování buněčné migrace do biomateriálů | Studování imunologických spouštěčů | Zkoumání abnormálního buněčného cyklu |
| Markery oxidačního stresu | Zkoumání účinků léku, který je ovlivněn gradienty prostředí | Sledování důsledků narušení hladin kyslíku nebo živin |
Monitorování aktivace imunitní odpovědi oxidačním stresem |
Studování patofyziologického prostředí lidských nádorových tkání |
| Nanočástice | Sledování lokalizace transportu léčiv | Zlepšení buněčné specifity biomateriálů | Studování použití nanočástic jako mediátorů zánětu |
Zkoumání cílené léčby rakovinných buněk |
Konfokální mikroskopy
Pro podobné experimenty se běžně používají konfokální mikroskopy (skenovací nebo s rotujícím diskem) nebo jiné sofistikované zobrazovací systémy vybavené kultivační komorou, které umožňují sledovat buňky dlouhodobě a s vysokým rozlišením. Příkladem takového přístroje je i ImageXpress® Pico (dále jen Pico) - plně automatizovaný systém pro zobrazovaní buněk. Tento digitální mikroskop disponuje vlastní inkubační komůrkou s teplotní regulací a kontrolou hladiny CO2, O2 a vlhkosti, do které lze umístit buňky na laboratorních sklíčkách, v mikrodestičkách či v Petriho miskách. Pro získání dat a snímků s optimálním zvětšením a citlivostí je k dispozici široká sada objektivů a filtrů pro nejčastěji používané fluorescenční barvičky jako je DAPI, FITC, Cy5 a jiné. V porovnání s konkurenčními přístroji má Pico několik zvýhodňujících unikátních funkcí, jako je digitální konfokální dekonvoluce, propracovaná funkce Autofocus, Life Preview funkce pro zjednodušené hledání oblasti zájmu nebo multi-wavelength mód pro zisk multiparametrického fenotypového profilu. Ovšem opravdu největší předností ImageXpress® Pico je software ‘‘CellReporterXpress‘‘ šitý přímo na míru tomuto přístroji. CellReporterXpress má snadné a intuitivní rozhraní a poskytuje komplexní kvantitativní analýzu snímků. Disponuje 25 přednastavenými protokoly od jednoduchého brightfield počítání buněk přes měření apoptózy, sledování mitochondrií a 3D buněčných modelů až po složitější analýzy, jako je trasování neuritů či kvantifikace infektivity virů.
Příklady aplikací pro ImageXpress Pico. Zleva apoptóza, kardiomyocyty, výzkum rakoviny
Fluorescenční a světelné mikroskopy
Pořízení konfokálního mikroskopu nebo imaging systému často vyžaduje velkou investici a pro práci s přístrojem je potřeba řádně proškolený personál v oblasti práce se softwarem a vyhodnocování získaných dat. Při rutinních experimentech ale není vždy potřeba vysokých rozlišení a složitých protokolů a stejně tak není potřeba blokovat často velmi vytížený konfokální mikroskop nebo zobrazovací systém. Navíc kultivační podmínky v inkubačním boxu jsou ve srovnání se specializovaným inkubátorem buněčných kultur náchylnější k výkyvům.
Elegantní a zároveň levnější alternativou je použití kompaktních světelných nebo fluorescenčních mikroskopů, které lze umístit přímo do inkubátoru, a experimenty pozorovat na dálku přímo z tepla vaší kanceláře nebo domova. Takové mikroskopy dodává nizozemská společnost CytoSMART a jejich přehled je k dispozici v tabulce pod textem. Mikroskopy jsou přes USB rozhraní připojeny k počítači a všechny pořízené snímky jsou automaticky nahrávány na cloudové úložiště, které je automaticky spojí do videí. Na cloudovém úložišti pak můžete pořízená videa vyhodnotit pomocí přednastavených algoritmů. Pro brightfield mikroskopy jsou dostupné algoritmy pro scratch eseje, sledování konfluence buněk nebo počítání kolonií. Fluorescenční mikroskopy pak kromě brightfield módu disponují i dvěma kanály pro zelenou a červenou fluorescenci a umožňují i počítání fluorescenčních objektů.
| Lux2 | Lux3 BR | Omni | Lux3 FL |
|
|
|
|
|
|
— Časosběrné obrázky a videa a integrovaná analýza obrazu pomocí chytrých algoritmů — Přizpůsobitelná emailová oznámení o úrovni konfluence — Snadné použití — Kompatibilní se širokou škalou kultivačních nádob — Inovativní a bezpečné ukládání dat na cloud — Nejmenší automatizovaný mikroskop pro zobrazování živých buněk na trhu |
— Vysoce kvalitní snímky pro přesné analýzy a vědecké publikace — Analýza konfluence a migračních esejí ve světelném poli — Časosběrné obrázky a videa pro zkoumání buněčných procesů — Plně vzdálený přístup přes cloud, umožňuje kontrolu buněčné kultury bez nutnosti vstupu do laboratoře — Malé, přenosné a snadno použitelné zařízení |
— Nabízí kompletní obraz o vzorku od celkového přehledu až po všechny detaily díky vysoce výkonným algoritmům — Časosběrné obrázky a videa celé kultivační nádoby, nebo 6-384 jamkové destičky — Kompatibilní s jakoukoli průhlednou kultivační nádobou — Sledujte své buňky a upravujte nastavení experimentu na dálku díky cloudovému úložišti — Vhodný pro všechny typy inkubátoru |
— Brightfield, zelený a červený fluorescenční kanál — Časosběrné obrázky a videa s vysokým rozlišením a zpracováním obrazu pomocí chytrých algoritmů — Kompatibilita s mnoha fluorescenčními barvičkami a proteiny — Nastavitelná intenzita LED = minimalizace fototoxicity a „fotobleachingu“ — Inovativní a bezpečné ukládání dat na cloud — Vhodný do každého inkubátoru |
STÁHNOUT TABULKU S MIKROSKOPY V PDF
Více se o těchto mikroskopech se dozvíte u jednotlivých produktů na našem e-shopu zde.
V případě zájmu o nabízené přístroje nás neváhejte kontaktovat. Rádi vám poskytneme veškeré informace a po předchozí domluvě zapůjčíme i demo přístroj na vyzkoušení.
Rychlý kontakt pro vaše dotazy
Mgr. Patrícia Holubová, patricia.holubova@eastport.cz, 721 867 038