Plexor™ qPCR and qRT-PCR systémy shrnují výhody specifické interakce mezi dvěma
modifikovanými nukleotidy k dosažení kvantitativní PCR analýzy. Jeden z PCR
primerů je značen fluorescenční značkou a to na iso-dC zbytku 5' konce. Druhý
primer není značen. Reakční mix obsahuje deoxyribonukleotidy a iso-dGTP
modifikovaný zhášečem (quencher dabcyl). Dabcyl-iso-dGTP se přednostně váže na
základě komplementarity s iso-dC zbytkem. Tato vazba se ve výsledku projeví
zhášením fluorescenčního signálu na komplementárním řetězci. Redukce
fluorescence umožňuje kvantifikaci v průběhu amplifikace.
Je možné provádět kvantifikaci mnoha cílů v rámci jedné reakce. V případě těchto
„multiplex“ reakcí je pro každou cílovou sekvenci použit pár primerů značený
jiným fluoroforem. Plexor™ qRT-PCR systém lze využít pro kvantifikaci specifické
sekvence RNA vzorku. Rovněž jej lze využít pro kvantifikaci specifické sekvence
DNA vzorku. Základní matricí může být jakýkoliv typ vzorku DNA (genomová DNA,
cDNA, mitochondriální DNA, virová DNA). Pomocí Plexor™ qPCR systému lze i
genotypizovat.
Nejlépe vystihuje princip Plexor systemu online animace se zvukem. Poslechnout si ji můžete zde!
Plexor™ qPCR system (A4031)
Plexor™ One-Step qRT-PCR system (A4041)
Plexor™ Two-Step qRT-PCR system (A4061)
Podrobné technické manuály (#TM262, #TM263, #TM264) k těmto systémům jsou ke
stažení na internetových stránkách Promegy, nebo Vám je rádi přepošleme.
Applied Biosystems 7300 a 7500 Real Time PCR systemy
ABI PRISM® 7000 Sequence Detection system
ABI PRISM® 7700 Sequence Detection system
Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR system
LightCycler® 1.0 system
iCycler® Thermal Cycler
DNA Engine Opticon® 2 Fluorescence Detection system
SmartCycler® II system
Mx3000P® and Mx3005P® Real-Time PCR systemy
Mx4000® Multiplex Quantitative PCR system
Roche LightCycler® 2.0 systém
a další ….
Promega vytvořila Plexor™ Primer Design Software pro návrh primerů k Plexor™ qPCR and qRT-PCR systémům. Plexor™ Primer Design Software pomáhá při výběru fluorescenčních značek pro monoplex a multiplex qPCR a qRT-PCR reakce. Zahrnuje výběr fluorescenčních reporterů pro zadaný typ real-time přístroje u zákazníkem upřednostňovaného výrobce oligonukleotidů. Fluorescenčně značené primery musí být objednány s iso-dC zbytkem sousedícím na 5'konci s fluorescenční značkou. Tento software je k dispozici na webu Promegy zdarma!
Pro výrobu primerů s iso-dC byly licencovány společnosti:
IDT
Biosearch Technologies
Eurogentec
Získaná data lze analyzovat pomocí Plexor™ Analysis Softwarem. Tento software
umožňuje porovnat klesající fluorescenční signál reakce se standardní křivkou
pro výpočet Ct (cycle treshold) a koncentrace neznámých vzorků. Software rovněž
generuje teplotní křivku (thermal melt curve) pro výpočet Tm teploty (melt
temperature) amplifikovaného produktu a odhalení amplifikace nechtěných
produktů. Plexor™ Analysis Software zahrnuje pět možností reportů, které
umožňují uložení nebo tisk detailů týkajících se vzorků (např. ID vzorku,
barevné značky, Ct, Tm a koncentrace, aplikovatelnost-platnost, zda má vzorek
předpokládanou Tm), threshold hodnoty, základní oblasti další informace o
průběhu reakce.
Plexor™ Analysis Software je ke stažení na webové adrese zde!
Schematický diagram ilustrující Plexor™ qPCR real-time PCR proces.
Charakteristická amplifikační křivka Plexor™ qPCR systému:
Amplifikační křivka ukazuje fluorescenci (v relativních fluorescenčních
jednotkách, RFU) každého reakčního cyklu. Amplifikační práh (treshold) je
vyznačen horizontální linií v grafu. Tato linie udává tzv. práh cyklu (Ct cycle
treshold) pro vzorky. Plexor™ qPCR systém umožňuje využití "melt" křivky nebo
disociační křivky pro determinaci Tm teploty (melting temperature) produktů po
amplifikaci. Toto je užitečné pro stanovení specificity reakce a rovněž v
případech, kdy je Plexor™ qPCR systém využíván ke genotypizaci.
Charakteristická „melt“ křivka Plexor™ qPCR systému.
